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線粒體異檸檬酸脫氫酶活性檢測(cè)試劑盒

線粒體異檸檬酸脫氫酶活性檢測(cè)試劑盒

線粒體異檸檬酸脫氫酶（ICDHm）活性測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)
分光光度法
注意：正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定
貨號(hào)：BC2160
規(guī)格：50 管/48 樣

產(chǎn)品組成：
試劑一：50mL×1 瓶，-20℃保存；
試劑二：10mL×1 瓶，-20℃保存；
試劑三：1mL×1 支，-20℃保存；
試劑四：液體 60mL×1 瓶，4℃保存；
試劑五：粉劑×1 支，4℃保存；
試劑六：粉劑×1 支，-20℃保存；
試劑七：粉劑×1 支，-20℃保存; 臨用前加入 3mL 蒸餾水充分混勻待用，現(xiàn)配現(xiàn)用。
工作液的配制：臨用前把試劑五、試劑六轉(zhuǎn)移到試劑四中混合溶解待用；用不完的試劑 4℃保存一周；

產(chǎn)品說(shuō)明：
ICDHm（EC 1.1.1.41）廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞的線粒體中，在三羧酸循中催化異檸檬酸生成α-酮戊二酸，同時(shí)將 NAD+ 還原為 NADH，是三羧酸循環(huán)的限速酶之一，其催化的反應(yīng)是細(xì)胞 NADH 主要來(lái)源之一。ICDHm 催化 NAD+ 還原生成 NADH，導(dǎo)致 340nm 處光吸收上升。

需自備的儀器和用品
紫外分光光度計(jì)、水浴鍋、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、1 mL 石英比色皿、研缽、冰和蒸餾水。

操作步驟：
一、 樣本的前處理：
組織、細(xì)菌或細(xì)胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離：
1、 稱(chēng)取約 0.1g 組織或收集 500 萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞，加入 1mL 試劑一和 10uL 試劑三，用冰浴勻漿器或研缽勻漿。
2、 將勻漿 600g，4℃離心 5min。
3、 棄沉淀，將上清液移另一離心管中，11000g，4℃離心 10min。
4、 上清液即胞漿提取物，可用于測(cè)定從線粒體泄漏的 ICDHm（此步可選做）。
5、 在步驟④的沉淀中加入 200uL 試劑二和 2uL 試劑三，超聲波破碎（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3 秒，間隔 10 秒，重復(fù) 30 次），用于線粒體 ICDHm 活性測(cè)定。

二、 測(cè)定步驟
1、 分光光度計(jì)預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng) 340nm 處，蒸餾水調(diào)零。
2、 工作液于 37℃（哺乳動(dòng)物）或 25℃（其它物種）孵育 5min。
3、在 1mL 石英比色皿中依次加入 60μL 試劑七、80μL 樣本和 1mL 工作液，混勻，立即記錄 340nm處 20s 時(shí)的吸光值 A1 和 2min20s 時(shí)的吸光值 A2，計(jì)算ΔA=A2-A1。

三、 ICDHm 活性計(jì)算
（1） 按樣本蛋白濃度計(jì)算
單位的定義：每 mg 組織蛋白每分鐘生成 1 nmol 的 NADH 定義為一個(gè)酶活性單位。
ICDHm 活性（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(Cpr×V 樣) ÷T=1145×ΔA÷Cpr
（2） 按樣本鮮重計(jì)算
單位的定義：每 g 組織每分鐘生成 1 nmol 的 NADH 定義為一個(gè)酶活性單位。
ICDHm（nmol/min /g 鮮重）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(W ×V 樣÷V 樣總) ÷T=231.3×ΔA÷W
（3） 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算
單位的定義：每 1 萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘生成 1 nmol 的 NADH 定義為一個(gè)酶活性單位。
ICDHm 活性（nmol/min/104 cell）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(500×V 樣÷V 樣總)÷T=0.463×ΔA

V 反總：反應(yīng)體系總體積，1.14×10-3 L；
ε：NADH 摩爾消光系數(shù)，6.22×103L / mol /cm；
d：比色皿光徑，1cm；
V 樣：加入樣本體積，0.08 mL；
V 樣總：加入提取液體積，0.202 mL；
T：反應(yīng)時(shí)間，2min；
Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；
W：樣本質(zhì)量，g；
500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500 萬(wàn)

相關(guān)文獻(xiàn)：

《lncRNA Ftx promotes aerobic glycolysis and tumor progression through the PPARγ pathway in hepatocellular carcinoma》 作者:Xiao Li, Qi Zhao, Jianni Qi, Wenwen Wang ,Di Zhang ,Zhen Li, Chengyong Qin 期刊:International Journal of Oncology 影響因子:3.571 PMID:29845188
《Cell death induced by α-terthienyl via reactive oxygen species-mediated mitochondrial dysfunction and oxidative stress in the midgut of Aedes aegypti larvae》 作者:JieZhangaShakilAhmadaLan-YingWangaQianHanbJian-ChunZhangaYan-PingLuo 期刊:Free Radical Biology and Medicine 影響因子:5.657 PMID:31022448